辣椒(Capsicum spp.)是一种世界性的蔬菜作物，辣椒属(Capsicum)大约有25个种，其中5个为栽培种(邹学校, 2009, 科学出版社, pp.9-58)，大多数分布在南美洲，其中几个栽培种分布在世界各地。由于辣椒适应性强，风味特别，营养成分丰富，用途广泛，加之其类型多，能够满足不同消费者的需要。

尽管各辣椒育种或科研团队已收集了较多辣椒种质资源，但大部分都停留在资源的形态评价及描述阶段(王述彬等, 2001; 陈学军等, 2009)。利用分子标记技术，如：如RFLP (Prince et al., 1992)、RAPD (张璐等, 2003; 陈学军等, 2006; Sanatombi et al., 2010; 李永平等, 2011)、AFLP (Lefebvre et al., 2001)、SSR (杜晓华等, 2006; 陈学军等, 2012)、SRAP (杜晓华等, 2006; 周坤华等, 2011; 陈学军等, 2012)和ISSR (杨若林等, 2005; 陈学军等, 2007; 孟金贵等, 2012)开展了部分辣椒种质资源分析研究工作，取得了较好成效，但相对滞后于辣椒种质资源的开发和利用。特别是从辣椒种群角度进行种质资源的起源演化、挖掘不同栽培种的有的基因和拓宽一年生辣椒的遗传基础均有十分重要的意义。

本研究以辣椒属的一年生辣椒(Cpsicum annuum L.)、中华辣椒(Cpsicum chinense Jacquin)和一份观赏用辣椒资源(Cpsicum spp.)共30份辣椒资源为试材，采用ISSR分子标记技术进行辣椒种质资源的分类鉴定、亲缘关系分析以及不同栽培种遗传结构分析，为辣椒种质资源的准确鉴定和科学利用提供相关理论基础。

1结果与分析
1.1 DNA提取与ISSR引物分析
提取得到的DNA 经凝胶电泳检测，带型整齐一致，无降解现象，将DNA浓度调整到40 ng/μL 进行ISSR-PCR 反应扩增。从44个ISSR引物中筛选出16个引物(表1)在辣椒材料中可以稳定清晰的扩增出条带。16条ISSR引物在30个辣椒样品中共产生293条带(图1)，多样性条带245条，多样性位点百分率83.62%，说明所检测的样品具有较高的遗传多样性。16条ISSR引物的平均多元率(Multiplex ration) 为18/引物，多样带多元率为15/引物。

图1 引物38在30个辣椒材料中的ISSR-PCR扩增电泳图谱 Figure 1 ISSR-PCR amplification patterns of 30 of Capsicum spp. using primer 38

表1 30份辣椒资源16条ISSR引物PCR扩增位点的多样性 Table 1 Polymorphism of loci PCR amplified with 16 ISSR primer among the 30 Capsicum materials

1.2聚类分析
基于遗传相似性系数的UPGMA法聚类分析结果表明，30个辣椒种质的遗传相似性系数在0.64-0.89之间，从图2可知，遗传相似性系数约在0.68时，可以把30个辣椒种质资源分为二个群，编号11、12、13、14、15、17的6个辣椒种质归为第I类，6个辣椒种质为中华辣椒(Cpsicum chinense Jacquin)；而另外的24个材料归为第II类，这24个种质为一年生辣椒(Capsicum annuum L.)。

图2 30个辣椒材料的ISSR聚类分析 Figure 2 UPGMA analysis of 30 Capsicum spp. revealed by ISSR

从图2可知，这24个材料，又可分为4个聚类群，1-10为第1个聚类群，1-8从中国广东收集，而材料8从中国重庆引进，为观赏辣椒，材料编号为9、10的2个材料为自创；材料编号为18、19、21、23、24、26、27、28、29、30、22、25等12 个材料为第2个聚类群；编号为16辣椒资源为第3个聚类群；编号为20辣椒资源为第4个聚类群；编号为18-25的8个材料从Malaysia引进，其中18、19、21-25等7个材料为第2个聚类群，而编号为20的材料却为第4聚类群，从植物的外观形态特征分析，18、19、21-25等7个材料果实朝向为下，而编号为20的辣椒材料果实朝向向上。另外，编号为16的辣材料引自Mexico。

1.3主坐标分析
应用30份辣椒种质资源ISSR-PCR电泳结果进行两维空间主坐标分析(principal coordinate analysis, PCOA)。第一维(横坐标1)和第二维(纵坐标2)主坐标分别代表了34.54%和15.23%的变异，前三个主坐标共代表了58.59%的变异。PCOA分析可将30个辣椒材料分为5个聚类群(图3; 图4)，主坐标分析基本上证实了聚类分析的结果。

图3 30个辣椒材料的ISSR标记POCA分析 Figure 3 Two-dimensional results of POCA in 30 Capsicum spp.

图4 30个辣椒材料的ISSR标记POCA分析 Figure 4 Two-dimensional results of POCA in 30 Capsicum spp.

1.4种群遗传多样性和遗传结构分析
16条ISSR引物在一年生辣椒(Capsicum annuum L.)和中华辣椒(Capsicum chinense Jacquin)2个辣椒栽培种共30份种质扩增的293个位点中，未发现栽培种群间特异性位点。一年生辣椒(Capsicum annuum L.)和中华辣椒(Capsicum chinense Jacquin)栽培种平均多态位点比例分别是73.04%和59.39%(表2)，Nei's基因多样性指数(h)和Shannon信息指数(I)在2个栽培种中分别为0.2229和0.2157、0.3392和0.3210。由上述参数的比较结果表明，一年生辣椒的遗传多样性稍高于中华辣椒。

表2 辣椒二个栽培种群ISSR的遗传多样性指标 Table 2 Genetic diversity index within populations of Capsicum by ISSR

30份辣椒种质所属的2个栽培种间的遗传分化系数(Gst)为0.2019，即辣椒的遗传多样性大部分(79.82%)存在于这2个栽培种内，只有20.19%存在于这2个栽培种间。Wright 认为，当基因流Nm>1时，基因流就可以防止遗传漂变引起种间的遗传分化。本研究所得到的辣椒的基因流(Nm)为1.9767，大于1，2个辣椒栽培种间不存在明显的遗传分化，能进行种间基因交换。本研究所选用的这2个辣椒栽培种间的遗传距离(D)为0.1533，2个栽培种间遗传一致度(NGI)为0.8579 (表2)，这与Nei's的遗传分化系数(Gst)值较低相吻合。
 
2讨论
2.1 ISSR在辣椒种质鉴定中的作用
本研究从最初的44 个ISSR引物中筛选到16个稳定性好的多样性引物，这16个引物平均扩增条带数为18条，平均多态条带数为15条。杨若林等(2005)、陈学军等(2007)、刘林娅等(2013)采用ISSR标记开展辣椒种质资源遗传多样性研究均取得了较好的效果。另外，从构建的遗传相似系数和分子树状图及两维空间主坐标分析可知，ISSR标记可以把30个辣椒种质分为2类，编号11、12、13、14、15、17的6个辣椒种质为第I类—中华辣椒(Capsicum chinense Jacquin)，而另外的24个材料为第II类—一年生辣椒(Capsicum annuum L.)，同时编号为8的观赏椒被归为第II类—一年生辣椒(Capsicum annuum L.)。由此表明，ISSR标记研究辣椒种质资源鉴定方面，是一种有效的分子标记。
 
2.2辣椒的遗传多样性
近年来对辣椒的遗传多样性研究已有大量的报道(陈学军等, 2012)，但对辣椒不同栽培种的遗传多样性研究相对较少(孟金贵等, 2012)。本文通过对一年生辣椒和中华辣椒2个辣椒栽培种的ISSR分析，一年生辣椒和中华辣椒的多样性位点百分率分别为73.04%和59.39%，物种水平上为83.62%，说明一年生辣椒遗传多样性水平相对中华辣椒较高，通过Shannon多样性指数的分析同样得出了以上结论。这与前人的研究有所不同，Prince等(1992; 1995)研究认为一年生辣椒种内遗传多样性水平较低。本实验所选试材中华辣椒为地方品种，以自花授粉为主，因此自交是维持遗传多样性水平较低的原因。另外还可能与检测样本大小及所使用的分子标记不同有关。一年生辣椒(Capsicum annuum L.)是辣椒属中分化最多、栽培最广的一个种(邹学校, 2009, 科学出版社, pp.9-58)，与长期的自然选择与人工选择中积累了丰富的遗传变异有关。
 
2.3辣椒的遗传结构
有研究指出，不同交配类型的物种，其种间的Gst存在显著差异(Nybom, 2004)。本文的2个辣椒栽培种的基因分化系数Gst (0.2019)较接近于混交(mixed mating)(Gst为0.20)类型，而与自交(selfing mating) (Gst为0.59)和远交(outcrossing mating) (Gst为0.22)相差较大。利用Shannon多样性指数(I)、基因分化系数(Gst)等遗传参数分析辣椒的遗传结构，结果表明辣椒的遗传变异主要存在于种内个体间，2个栽培种间没有明显的遗传分化。2个栽培种间遗传一致性(NGI)较大为0.8579，种间基因分化系数(Gst)较小仅为0.2019，这可能与一年生辣椒与中华辣椒的可交配性和杂种的可育性有关。
 
Toquica等(2003)用AFLP标记对美洲亚马逊地区辣椒种质资源进行分析，发现5个栽培种的基因分化系数(Gst)为0.331，而陈学军等(2007)对5个辣椒栽培种进行RAPD、ISSR分析，其基因分化系数(Gst)分别为0.2969和0.4357。Nybom(2004)研究也认为，不同分子标记在研究同一批材料时其基因分化系数(Gst)一般也不同。显然，本研究结果与前人对辣椒种质的研究稍有偏差。这其中可能存在着多种原因，如试材为辣椒属下的不同栽培种，取样的有限性及偶然性，研究方法的不同及实验误差等。要真实的反映出辣椒属的遗传变异还需要进行更为全面，更为充分地研究。

3材料与方法
3.1材料
30份种质由广东省农业科学院蔬菜研究所辣椒育种与生物技术团队提供，其中种质编号1至10以及编号27至30分别来自中国各省区、编号18至25引自马来西亚、编号11和16引自墨西哥、编号15引自牙买加、编号12和17引自秘鲁、编号13和14来自特立尼达、编号26辣椒种质引自美国等地的特色优势辣椒种质资源(表3)。编号为1、3、8、26的4个辣椒种质特耐高温多湿；而编号8的辣椒材料为叶、果均为紫色观赏椒，相关文献报道其为一年生辣椒(Cpsicum annuum L.)或灌木状辣椒(Cpsicum frutescens L.)。

表3 材料来源及类型 Table 3 Materials for study of phylogeny of Capsicum spp. from different localities

3.2基因组DNA的提取
在苗期采摘无病虫害辣椒嫩叶提取基因组DNA，提取方法参照CTAB法，试验所用的Taq DNA 聚合酶、缓冲液和dNTP均购自上海Sangon公司，ISSR引物(表1)也由上海Sangon公司合成。
 
3.3 ISSR-PCR反应
ISSR反应体系为：10×PCR buffer 2.0 μL，25 mmol/L MgCl₂ 1.6 μL，模板(40 ng/μL) 1.0 μL，引物(10 μmol/L) 1.0 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，2.0 mmol/L dNTPs 1.6 μL。加ddH₂O补足20 μL。ISSR-PCR反应程序为：①94℃变性 3 min；②94℃ 30 s , 52℃/54℃ 30 s，72℃ 1.5 min，38循环；③72℃延伸10 min。④4℃保存。PCR产物在6%的聚丙烯酰胺上电泳，并进行简单快速的DNA银染。
 
3.4数据统计与处理
将电泳好染色，洗好的聚丙烯酰胺凝胶转移到玻璃板上，在灯箱上读带，记录下各个引物在辣椒材料中稳定扩增且清晰的条带数目，相同迁移距离的片段用“1”表示，无带用“0”表示。将统计好的数据用聚类分析软件NTsys 2.10e 软件进行聚类分析及主坐标分析。应用POPGENE 1.32程序进行数据处理，并进行下列参数统计：(1)多态位点百分率(P)；(2)Nei's基因多样性指数(h)；(3)Shannon 信息指数(I)；(4)基因分化系数(Gst)和基因流(Nm)；(5)Nei’s遗传距离(D)和遗传一致度(NGI)。
 
作者贡献
徐小万、徐晓美是本研究的实验设计和实验研究的执行人；李涛完成数据分析，论文初稿的写作；王恒明参与实验设计，试验结果分析；李颖、罗少波是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
 
致谢
本研究由广东省科技计划项目(2010B020304001, 2011B020303001, 2012B040400007)、广东省农科院院长基金项目(201108)和现代农业产业技术体系建设专项(CARS-25-G-36)共同资助。
 
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